Bio-Rad QX200 Droplet Digital PCR
Система капельной цифровой ПЦР (ddPCR). Генерация ~20 000 водно-масляных капель на лунку, амплификация в стандартном термоциклере, считывание на каплеридере. Абсолютная количественная оценка без стандартных кривых. 2 флуоресцентных канала (FAM/HEX).
ООО «Спин Аналитика» не осуществляет продажу оборудования. Платформа является информационно-навигационным сервисом.
Ключевые характеристики
| Тип | Капельная цифровая ПЦР (ddPCR) |
| Формат | 96-луночный планшет (PCR-совместимый) |
| Точность | CV <10% при >100 копиях; CV <25% при 10 копий |
| Каплеридер | QX200 DR (лазерная детекция, 1-2 мин/лунка) |
| Объём капли | ~1 нл |
| Термоциклер | Внешний (любой стандартный) |
| Генератор капель | QX200 DG (8 лунок одновременно) |
| Чувствительность | Мутантный аллель от 0.01% (1:10 000) |
| Количество капель | ~20 000 на лунку |
| Динамический диапазон | 1-120 000 копий/20 мкл реакции |
| Флуоресцентные каналы | 2 (FAM ~520 нм, HEX/VIC ~556 нм) |
| Программное обеспечение | QuantaSoft / QuantaSoft Analysis Pro |
Описание
Назначение
Bio-Rad QX200 Droplet Digital PCR - система цифровой ПЦР, основанная на разделении образца на ~20 000 водно-масляных капель (droplets) для абсолютной количественной оценки нуклеиновых кислот.
Место в линейке
QX200 - базовая модель ddPCR Bio-Rad. Старшая: QX600 (6 каналов, мультиплекс до 12 мишеней, более высокая автоматизация). QX200 - наиболее распространённая ddPCR-система в мире с крупнейшей установленной базой.
Bio-Rad является пионером и лидером рынка капельной цифровой ПЦР.
Принцип работы
Генерация капель: образец с реагентами ПЦР эмульгируется в масле на генераторе капель (QX200 Droplet Generator). Каждая лунка даёт ~20 000 капель объёмом ~1 нл. Каждая капля - независимый микрореактор.
Амплификация: планшет с каплями переносится в стандартный термоциклер (C1000 Touch, T100 или аналог). ПЦР проходит внутри каждой капли независимо.
Считывание: каплеридер (QX200 Droplet Reader) пропускает капли через лазерный детектор по одной. Каждая капля классифицируется как положительная (содержит мишень, флуоресцирует) или отрицательная (не содержит).
Расчёт: по соотношению положительных/отрицательных капель рассчитывается абсолютная концентрация мишени по статистике Пуассона. Стандартные кривые не нужны.
Позиция на рынке
QX200 - золотой стандарт капельной цифровой ПЦР. >5000 публикаций. Основные конкуренты: Stilla Technologies Naica (кристальная dPCR), Thermo Fisher QuantStudio Absolute Q (микрофлюидная dPCR), RainDance (капельная, поглощена Bio-Rad).
Ключевые технологии
Генерация водно-масляных капель
Микрофлюидный картридж создаёт эмульсию: водная фаза (образец + реагенты) разбивается на ~20 000 монодисперсных капель в масле. Капли стабильны при термоциклировании (не сливаются).
Монодисперсность критична: капли одинакового объёма обеспечивают корректный расчёт по Пуассону.
Бинарная классификация (0/1)
Каждая капля - либо 1 (положительная, содержит минимум одну копию мишени), либо 0 (отрицательная). Промежуточного нет. Это делает цифровую ПЦР нечувствительной к эффективности амплификации: даже если эффективность 70%, капля всё равно будет положительной.
Результат: ddPCR точнее qPCR при низких копийностях и в присутствии ингибиторов.
Статистика Пуассона
Если известна доля отрицательных капель (p0), средне число копий на каплю = -ln(p0). Умножая на количество капель и корректируя на объём, получаем абсолютную концентрацию (копий/мкл).
Не нужны стандартные кривые, калибраторы или референсные образцы.
2 флуоресцентных канала
FAM (520 нм) и HEX/VIC (556 нм). 2-канальное считывание позволяет: дуплексный анализ (2 мишени) или 2D-кластеризацию (до 4-6 мишеней при использовании амплитудного мультиплексирования с разными концентрациями зондов).
Для кого подходит
- Жидкостная биопсия - детекция циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA) с мутантным аллельным фракционированием (MAF) от 0.01%
- Количественная оценка ГМО - абсолютная количественная оценка трансгенных событий (например, MON810 в кукурузе) без стандартных кривых
- Определение копийности генов (CNV) - детекция делеций/дупликаций с разрешением 1 копия
- Валидация NGS-библиотек - точная количественная оценка библиотек перед секвенированием для оптимальной загрузки
- Мониторинг минимальной остаточной болезни (MRD) - детекция 1 мутантной клетки среди 10 000 нормальных
- Метагеномика - абсолютная количественная оценка микробных таксонов (а не относительная, как 16S qPCR)
Особенности эксплуатации
Программное обеспечение
QuantaSoft (или QuantaSoft Analysis Pro) - анализ данных ddPCR. 1D и 2D scatter plots, автоматическая установка порогов, расчёт концентрации, CNV, MAF. Экспорт в CSV.
Рабочий процесс (workflow)
- Подготовка реакционной смеси (образец + мастер-микс + зонды)
- Загрузка в генератор капель (8 лунок одновременно) - 2 мин
- Перенос капель в планшет - вручную пипеткой
- Термоциклирование - 90-120 мин в обычном термоциклере
- Считывание на каплеридере - 1-2 мин на лунку
Общее время: ~3-4 часа на 96 образцов.
Требования к установке
- Генератор капель (QX200 DG): настольный, отдельный прибор
- Каплеридер (QX200 DR): настольный, лазерный детектор
- Термоциклер: любой стандартный (96 x 0.2 мл)
- Компьютер: Windows PC с QuantaSoft
Обслуживание и расходные материалы
- DG8 картриджи (генерация капель): ~$5-8 за 8 лунок
- Масло для генерации капель: ~$100 за 200 анализов
- Планшеты: DG8 gaskets, PCR-планшеты
- Каплеридер: ежегодная калибровка
Обучение
Базовое: 2-3 дня. Критические навыки: аккуратный перенос капель (не разрушить), правильный выбор мастер-микса (ddPCR Supermix отличается от qPCR Master Mix).
Ограничения
- Только 2 канала (для >2 мишеней - амплитудное мультиплексирование или QX600)
- Ручной перенос капель - узкое место в workflow
- Стоимость анализа выше, чем qPCR ($5-10 за реакцию vs $1-2 для qPCR)
- Не подходит для скрининга (медленнее qPCR): ddPCR для подтверждения, qPCR для скрининга
- Динамический диапазон уже, чем у qPCR (1-120 000 копий/мкл vs 10^10 у qPCR)
Области применения
Сравнение с аналогами
Naica - система кристальной цифровой ПЦР: образец разделяется на ~25 000 разделов в кристальном чипе, а не в каплях. 3 флуоресцентных канала (vs 2 у QX200). Замкнутая система (нет переноса капель). QX200 выигрывает установленной базой (>5000 публикаций), стоимостью расходных и экосистемой. Naica - более автоматизирован и менее подвержен ошибкам переноса.
Absolute Q - микрофлюидная dPCR: образец разделяется на 20 000+ микрокамер в чипе. Замкнутая система (чип герметичен). Быстрее QX200 (90 мин полный цикл vs 3-4 часа). QX200 дешевле в расходных материалах и имеет значительно большую установленную базу. Absolute Q удобнее в рутинной работе (нет ручного переноса капель).
QX600 - следующее поколение ddPCR Bio-Rad: 6 каналов (vs 2 у QX200), мультиплекс до 12 мишеней, автоматизированный генератор капель. Совместим с теми же реагентами. QX200 дешевле и достаточен для дуплексных задач. QX600 - для сложных мультиплексных панелей и лабораторий с высокой загрузкой.
Частые вопросы
Зачем нужна ddPCR, если есть qPCR?
ddPCR даёт абсолютную концентрацию (копий/мкл) без стандартных кривых: результат не зависит от эффективности ПЦР. Это критично для: (1) редких мутаций (ctDNA 0.01% - qPCR не видит), (2) точной количественной оценки (CNV: отличить 2 копии от 3), (3) присутствия ингибиторов (ddPCR толерантнее, т.к. бинарная классификация). qPCR остаётся лучше для скрининга (быстрее, дешевле, шире диапазон).
Почему именно 20 000 капель?
20 000 капель по ~1 нл = 20 мкл суммарного объёма образца. Этого достаточно для статистически надёжного расчёта по Пуассону: при 1 копии мишени на 20 мкл ожидается ~1 положительная капля из 20 000 (детекция с 95% вероятностью). При 5 000 копиях насыщение ~22% положительных капель. Больше капель - шире динамический диапазон.
Можно ли мультиплексировать больше 2 мишеней на QX200?
Да, через амплитудное мультиплексирование: зонды с разными концентрациями дают разные уровни флуоресценции. На 2D scatter plot (FAM vs HEX) каждая комбинация мишеней образует отдельный кластер. Реально 4-6 мишеней, но дизайн требует тщательной оптимизации. Для нативного мультиплексирования >2 мишеней - QX600 (6 каналов).
Дополнительные материалы
Коды для госзакупок
Возможные коды ОКПД2 для закупки данного оборудования по 44-ФЗ и 223-ФЗ. Выбор кода зависит от назначения и контекста закупки.
Коды КТРУ регулярно обновляются Минфином и зависят от конкретных характеристик закупаемого оборудования (автоматическое/полуавтоматическое, с охлаждением/без и т.д.). Актуальные коды КТРУ доступны только в Единой информационной системе закупок.
Информация о кодах ОКПД2 носит справочный характер. Коды приведены в качестве примера возможных вариантов классификации данного оборудования. Выбор кода, его соответствие нормативно-правовым актам и целесообразность применения определяются заказчиком самостоятельно. ООО «Спин Аналитика» не несёт ответственности за некорректное применение указанных кодов при осуществлении закупочных процедур.