PacBio Sequel IIe
Секвенатор третьего поколения на основе технологии SMRT (Single Molecule Real-Time) с 8 млн ZMW-ячеек. Генерирует HiFi-риды длиной до 25 кб с точностью Q30+ (99,9%). Предшественник платформы Revio, остающийся в эксплуатации во многих геномных центрах.
ООО «Спин Аналитика» не осуществляет продажу оборудования. Платформа является информационно-навигационным сервисом.
Ключевые характеристики
| Тип | Секвенатор третьего поколения (long-read) |
| SMRT-ячейки | 1 ячейка за запуск (SMRT Cell 8M) |
| Форм-фактор | Напольный |
| Количество ZMW | 8 млн на SMRT-ячейку |
| Время запуска | 15-30 часов (зависит от длины библиотеки) |
| Формат данных | BAM (субриды + кинетика), FASTQ (HiFi CCS) |
| Длина ридов (макс) | HiFi: до 25 кб; CLR: до 100 кб |
| Мультиплексирование | До 384 образцов (баркодирование) |
| Выход данных за запуск | До 30 Гб HiFi / до 160 Гб CLR (1 SMRT-ячейка) |
| Точность чтения (HiFi Q30+) | >99,9% (Q30+) |
| Программное обеспечение | SMRT Link |
| Технология секвенирования | SMRT (Single Molecule Real-Time) |
Описание
Назначение
PacBio Sequel IIe - секвенатор третьего поколения для чтения длинных молекул ДНК в реальном времени. Прибор предназначен для задач, где критична длина ридов: сборка геномов de novo, фазирование гаплотипов, детекция структурных вариантов и эпигенетических модификаций.
Место в линейке
Sequel IIe - это обновлённая версия Sequel II с улучшенной вычислительной подсистемой для генерации HiFi-ридов на борту прибора. В линейке PacBio Sequel IIe занимает позицию предыдущего поколения. Текущий флагман Revio предлагает втрое больше ZMW-ячеек и возможность параллельной работы с 4 SMRT-ячейками.
Для коротких ридов PacBio выпустила отдельную платформу Onso, построенную на принципиально иной технологии SBB (Sequencing by Binding).
Принцип работы
Технология SMRT основана на наблюдении за единичной молекулой ДНК-полимеразы в нанофотонной ячейке (ZMW, zero-mode waveguide). Полимераза, иммобилизованная на дне ячейки, включает флуоресцентно-меченные нуклеотиды в растущую цепь. Каждое включение регистрируется камерой в реальном времени.
Для получения HiFi-ридов кольцевая библиотека (SMRTbell) прочитывается многократно. Консенсусная последовательность из нескольких проходов достигает точности Q30+ (более 99,9%).
Позиция на рынке
Sequel IIe остаётся рабочей платформой во многих геномных центрах, которые не перешли на Revio. Обширная база публикаций и отработанные протоколы делают систему предсказуемой в эксплуатации. Для новых закупок PacBio рекомендует Revio как замену с существенно более высокой производительностью.
Ключевые технологии
SMRT-секвенирование (Single Molecule Real-Time)
Каждая ZMW-ячейка представляет собой цилиндрический нанокарман диаметром около 100 нм в металлической плёнке. Лазерный свет проникает только в нижнюю часть ячейки, создавая сверхмалый объём детекции (зептолитры). Это позволяет наблюдать за одной молекулой полимеразы на фоне свободных флуоресцентных нуклеотидов в растворе.
Sequel IIe содержит 8 миллионов ZMW-ячеек на одной SMRT-ячейке. Каждая ячейка работает независимо, обеспечивая массовый параллелизм на уровне единичных молекул.
HiFi-риды (High-Fidelity)
Кольцевая библиотека SMRTbell позволяет полимеразе совершить несколько оборотов вокруг вставки. Из серии субридов формируется циклический консенсус (CCS). При 10-15 проходах по вставке длиной 15-20 кб точность достигает Q30+ (менее 1 ошибки на 1000 оснований).
HiFi-риды сочетают длину третьего поколения с точностью, сопоставимой с короткими ридами Illumina. Это устраняет традиционный компромисс между длиной и качеством.
Детекция эпигенетических модификаций
SMRT-секвенирование напрямую регистрирует модифицированные основания (5mC, 6mA, 4mC) без предварительной химической конверсии. Кинетика включения нуклеотида полимеразой изменяется вблизи модифицированного основания. Эти кинетические сигнатуры извлекаются вычислительно из данных секвенирования.
Программная платформа SMRT Link
SMRT Link управляет запусками, первичным анализом и генерацией HiFi-ридов. Встроенные пайплайны покрывают сборку генома, детекцию вариантов, анализ метилирования и изоформ транскриптов (Iso-Seq). Данные экспортируются в форматах BAM и FASTQ.
Для кого подходит
- Сборка геномов de novo - полные хромосомные сборки без фрагментации в повторах
- Детекция структурных вариантов - инверсии, транслокации, крупные инсерции/делеции
- Фазирование гаплотипов - разделение материнского и отцовского аллелей на протяжении десятков килобаз
- Эпигеномика - прямая детекция метилирования без бисульфитной конверсии
- Полноразмерное секвенирование транскриптома (Iso-Seq) - идентификация изоформ без сборки
- Метагеномика - видовая идентификация по полноразмерным генам 16S и функциональным генам
- Клиническая генетика - разрешение сложных локусов (HLA, PGx-гены, тринуклеотидные повторы)
- Секвенирование малых геномов - полные сборки бактерий и вирусов за один запуск
Особенности эксплуатации
Программное обеспечение
SMRT Link обеспечивает полный цикл работы: настройка запуска, мониторинг, генерация HiFi CCS-ридов, вторичный анализ. Поддерживается интеграция с облачной платформой PacBio для масштабного анализа данных.
Данные сохраняются в формате BAM (первичные данные с кинетикой) и FASTQ (HiFi-риды). Совместимость с основными биоинформатическими инструментами (minimap2, pbmm2, hifiasm).
Требования к установке
- Форм-фактор: напольный
- Масса: около 300 кг
- Температура: 18-26°C, стабильная
- Электропитание: выделенная линия, ИБП рекомендуется
- Вычислительный сервер входит в комплект поставки
Обслуживание и расходные материалы
Основные расходные материалы: SMRT-ячейки 8M, наборы для подготовки библиотек (SMRTbell prep kit), реагенты связывания и секвенирования. Стоимость одной SMRT-ячейки существенна, что делает планирование запусков важным фактором.
Калибровка и промывка системы выполняются через интерфейс SMRT Link. Периодическое техобслуживание лазерного модуля и оптической системы требует визита инженера.
Ограничения
- Производительность значительно уступает Revio (1 SMRT-ячейка за запуск против 4)
- Высокая стоимость расходных материалов в пересчёте на гигабазу
- Требуется высококачественная высокомолекулярная ДНК для длинных библиотек
- Габариты и масса требуют отдельного пространства в лаборатории
Области применения
Сравнение с аналогами
Revio - текущий флагман PacBio с 25M ZMW на SMRT-ячейку (против 8M у Sequel IIe) и возможностью параллельной работы с 4 ячейками. Производительность Revio составляет до 360 Гб HiFi за 24 часа, что в 15 раз превышает Sequel IIe. Sequel IIe может быть предпочтителен для небольших лабораторий с ограниченными объёмами секвенирования.
PromethION 2 Solo - нанопоровый секвенатор, читающий молекулы ДНК по изменению ионного тока при прохождении через белковую пору. Длина ридов потенциально неограничена (рекорды свыше 1 Мб). Точность единичных ридов ниже, чем HiFi (Q20 vs Q30+). PromethION 2 Solo значительно дешевле по стоимости прибора и запуска.
NovaSeq X Plus - ультравысокопроизводительный секвенатор коротких ридов (до 300 п.о.). Производительность составляет до 16 Тб за запуск, что на порядки превышает Sequel IIe. Однако короткие риды не справляются со структурными вариантами, повторами и фазированием гаплотипов. Многие проекты используют комбинацию: длинные риды PacBio для скелета сборки и короткие Illumina для полировки.
Частые вопросы
Чем Sequel IIe отличается от Sequel II?
Sequel IIe содержит обновлённый вычислительный модуль, позволяющий генерировать HiFi CCS-риды непосредственно на борту прибора. У Sequel II эта задача требовала отдельного вычислительного кластера. Оптическая система и SMRT-ячейки идентичны, расходные материалы полностью совместимы.
Стоит ли покупать Sequel IIe сейчас или лучше Revio?
Для новых закупок PacBio рекомендует Revio. Revio обеспечивает в 15 раз большую производительность на единицу стоимости за счёт 25M ZMW-ячеек и параллельной работы с 4 SMRT-ячейками. Sequel IIe остаётся актуальным для лабораторий с небольшими объёмами, где полная загрузка Revio не оправдана.
Какие требования к качеству ДНК?
Для HiFi-библиотек необходима высокомолекулярная ДНК с медианой фрагментов более 15 кб. Рекомендуемые методы выделения: Circulomics (Nanobind), MagAttract HMW, фенол-хлороформ с щадящими условиями. Фрагментированная или деградированная ДНК приведёт к коротким вставкам и снижению выхода HiFi-ридов.
Дополнительные материалы
Коды для госзакупок
Возможные коды ОКПД2 для закупки данного оборудования по 44-ФЗ и 223-ФЗ. Выбор кода зависит от назначения и контекста закупки.
Коды КТРУ регулярно обновляются Минфином и зависят от конкретных характеристик закупаемого оборудования (автоматическое/полуавтоматическое, с охлаждением/без и т.д.). Актуальные коды КТРУ доступны только в Единой информационной системе закупок.
Информация о кодах ОКПД2 носит справочный характер. Коды приведены в качестве примера возможных вариантов классификации данного оборудования. Выбор кода, его соответствие нормативно-правовым актам и целесообразность применения определяются заказчиком самостоятельно. ООО «Спин Аналитика» не несёт ответственности за некорректное применение указанных кодов при осуществлении закупочных процедур.