Standard BioTools Helios (CyTOF)
Масс-цитометр (CyTOF), использующий металл-конъюгированные антитела и времяпролетную масс-спектрометрию вместо флуоресценции. Одновременная детекция 50+ параметров без спектрального перетока и необходимости компенсации. Платформа для высокоразмерного одноклеточного анализа. Ранее - Fluidigm Helios.
ООО «Спин Аналитика» не осуществляет продажу оборудования. Платформа является информационно-навигационным сервисом.
Ключевые характеристики
| Тип | Масс-цитометр (CyTOF, ICP-TOF-MS) |
| Метки | Стабильные изотопы лантаноидов (диапазон масс 75-209 Да) |
| Баркодинг | До 20 образцов в одном запуске (палладий/индий) |
| Размещение | Стационарный, требуется выделенное помещение с аргоном |
| Газ-носитель | Аргон сверхчистый (расход ~15-20 л/мин) |
| Формат данных | FCS 3.0 |
| Принцип детекции | Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой и времяпролетным анализатором |
| Скорость анализа | 300-1 000 событий/сек |
| Параметры детекции | 50+ одновременных параметров (металл-конъюгированные антитела) |
| Спектральный переток | < 1-3% (компенсация практически не требуется) |
| Динамический диапазон | ~4,5 порядков |
| Программное обеспечение | Standard BioTools CyTOF Software |
Описание
Назначение
Standard BioTools Helios - масс-цитометр, работающий по принципиально иной технологии, чем флуоресцентные проточные цитометры. Вместо флуорохромов антитела конъюгированы с редкоземельными металлами (изотопами лантаноидов), а детекция осуществляется масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой и времяпролетным анализатором (ICP-TOF-MS).
Место в линейке
Helios - третье поколение CyTOF-платформы (после CyTOF и CyTOF2), обеспечивающее улучшенную чувствительность, стабильность и пропускную способность. Прибор изначально разработан DVS Sciences, коммерциализирован Fluidigm Corporation (переименована в Standard BioTools в 2022 году).
Новейшая система CyTOF XT расширяет автоматизацию и пропускную способность.
Принцип работы
Каждая клетка, меченная металл-конъюгированными антителами, распыляется в аргоновой плазме (~7000 К), полностью ионизируется. Ионы металлов направляются во времяпролетный масс-анализатор (TOF), который разделяет их по массе.
Масс-спектр каждой клетки содержит информацию обо всех металлических метках одновременно. Перекрытие масс-спектральных пиков менее 1-3%, что делает компенсацию практически ненужной.
Позиция на рынке
CyTOF стал золотым стандартом для высокоразмерного одноклеточного анализа в иммуноонкологии, аутоиммунных заболеваниях, вакцинологии и трансплантационной иммунологии. Конкуренция с полноспектральными цитометрами (Cytek Aurora, Sony ID7000) идет по разным осям: CyTOF выигрывает по отсутствию перетока, флуоресцентные платформы - по скорости и возможности сортировки.
Обширная база публикаций и участие в проекте Human Cell Atlas закрепили позицию CyTOF в трансляционных исследованиях.
Ключевые технологии
ICP-TOF масс-спектрометрия
Клетка, меченная металл-конъюгированными антителами, распыляется в аргоновой плазме (температура ~7000 К). Все атомы полностью ионизируются. Ионы направляются во времяпролетный масс-анализатор.
TOF разделяет ионы по массе: легкие достигают детектора раньше тяжелых. Масс-спектр каждой клетки анализируется в одном TOF-импульсе, обеспечивая полную синхронность измерения.
Металл-конъюгированные антитела (MaxPar)
Антитела конъюгированы с хелатирующими полимерами (MaxPar), несущими множество атомов выбранного изотопа (153Eu, 159Tb, 165Ho, 175Lu и др.). Используются стабильные изотопы, отсутствующие в биологических системах.
Линейка MaxPar включает более 400 готовых конъюгатов. Доступны наборы для самостоятельной конъюгации произвольных антител.
50+ параметров без компенсации
Масс-спектрометрия разделяет сигналы на основе атомной массы. Перекрытие масс-спектральных пиков соседних изотопов составляет менее 1-3% (против 10-40% для типичных пар флуорохромов).
Исследователь может добавлять маркеры без беспокойства о спектральном перетоке. Дизайн панелей на 40-50 маркеров принципиально проще, чем на флуоресцентных платформах.
Баркодинг образцов
Технология позволяет метить разные образцы уникальными комбинациями металлических баркодов (палладий, индий), объединять в один пул и анализировать одновременно. ПО демультиплексирует события после анализа.
Это устраняет межпробную вариабельность и увеличивает пропускную способность (до 20 образцов в одном запуске).
Чувствительность на уровне единичных атомов
ICP-TOF-MS детектирует метки на уровне нескольких сотен атомов на клетку. Динамический диапазон составляет 4-5 порядков, чувствительность сопоставима с ярким флуоресцентным красителем.
Разрешающая способность TOF достаточна для надежного разделения всех используемых изотопов в диапазоне масс 75-209 Да.
Для кого подходит
- Системная иммунология - комплексная характеристика иммунных клеток с панелями 30-50 маркеров, построение атласов иммунных клеток
- Иммуноонкология - глубокое профилирование опухолевого микроокружения, анализ иммунных чекпоинтов, оценка CAR-T и других иммунотерапий
- Трансляционная медицина - мониторинг иммунного ответа в клинических исследованиях, стратификация пациентов
- Аутоиммунные заболевания - характеристика аутореактивных клеток, анализ цитокинового профиля на одноклеточном уровне
- Вакцинология - одновременное измерение поверхностных маркеров, внутриклеточных цитокинов и функциональных параметров
- Гематология и онкогематология - глубокое фенотипирование лейкозов и лимфом, минимальная остаточная болезнь
- Фундаментальная клеточная биология - многопараметрическое профилирование сигнальных путей (фосфо-CyTOF), анализ эпигенетических модификаций
Особенности эксплуатации
ПО
Standard BioTools CyTOF Software - комплексное ПО для управления прибором, калибровки, сбора данных и первичной обработки. Выходные данные - файлы FCS 3.0, совместимые с FlowJo и Cytobank.
Для высокоразмерного анализа используются специализированные алгоритмы: viSNE (визуализация), SPADE (кластеризация), CITRUS (стратификация), FlowSOM (самоорганизующиеся карты).
Установка
- Форм-фактор: крупный стационарный прибор
- Требуется постоянное снабжение сверхчистым аргоном (~15-20 л/мин)
- Выделенное помещение с вентиляцией и кондиционированием (18-25 C, влажность 30-60%)
- Значительный тепловой поток и шум
Обслуживание
Подготовка к работе: прогрев аргоновой плазмы (15-30 мин), калибровка масс-анализатора (EQ Four Element Calibration Beads), проверка чувствительности. Полная процедура - 30-45 минут.
Регулярная чистка конусов (самплер и скиммер), замена детектора при снижении чувствительности, ежегодное профилактическое обслуживание. Расход аргона - значимая статья расходов.
Обучение
Переход с флуоресцентной цитометрии требует значительных усилий. Пробоподготовка отличается: окрашивание металл-конъюгатами, фиксация, интеркалирование ДНК. Анализ 50+ параметров невозможен традиционным гейтингом - необходимы алгоритмы снижения размерности (tSNE, UMAP) и кластеризации (FlowSOM, Phenograph).
Рекомендуется обучение у производителя (2-3 дня) и период освоения 2-3 месяца.
Ограничения
- Скорость анализа 300-1 000 событий/сек - на 2-3 порядка ниже флуоресцентных цитометров
- Клетки разрушаются в аргоновой плазме - сортировка невозможна
- Стоимость металл-конъюгированных антител выше флуорохром-конъюгатов
- Каталог готовых конъюгатов уступает по ширине ассортименту флуоресцентных антител
Области применения
Сравнение с аналогами
Cytek Aurora - спектральный флуоресцентный цитометр с до 5 лазерами и 64+ детекторами (40+ маркеров). Скорость - до 35 000 событий/сек (в 35-100 раз быстрее CyTOF). Aurora позволяет анализировать живые клетки и совместима с сортировкой (Aurora CS). Спектральный переток требует unmixing. CyTOF превосходит по числу параметров без перетока, но проигрывает по скорости и не поддерживает сортировку.
BD FACSymphony A5 SE - флагманский спектральный анализатор BD с до 5 лазерами и 50+ параметрами. Обеспечивает высокую скорость (до 100 000 событий/сек) и совместим с сортировочными модулями. CyTOF превосходит по отсутствию спектрального перетока и простоте дизайна панелей, но уступает по скорости и стоимости эксплуатации.
Sony ID7000 - спектральный анализатор с до 7 лазерами и 186 детекторами (44+ флуоресцентных параметра). Максимальное число параметров среди флуоресцентных платформ. Скорость - до 100 000 событий/сек. CyTOF имеет меньший спектральный переток и большее число каналов (50+), однако ID7000 радикально превосходит по скорости и позволяет работать с живыми клетками.
Частые вопросы
Если CyTOF детектирует 50+ параметров, зачем нужны флуоресцентные цитометры?
CyTOF и флуоресцентная цитометрия - взаимодополняющие технологии. Флуоресцентные цитометры анализируют 50 000-100 000 клеток/сек (CyTOF - 300-1 000), позволяют сортировать живые клетки (CyTOF разрушает клетки), дешевле в эксплуатации. CyTOF незаменим, когда необходимы 30-50+ параметров без компенсации, но для рутинного фенотипирования и сортировки флуоресцентная цитометрия эффективнее.
Можно ли сортировать клетки на CyTOF Helios?
Нет. В процессе анализа клетки полностью разрушаются в аргоновой плазме при температуре около 7000 К. Сортировка живых клеток принципиально невозможна. Для задач, требующих высокоразмерной характеристики с последующей сортировкой, используют CyTOF для идентификации маркерного профиля, затем флуоресцентную сортировку (FACS) по ключевым маркерам.
Насколько сложно перейти с флуоресцентной цитометрии на CyTOF?
Переход требует значительных усилий. Пробоподготовка отличается: окрашивание металл-конъюгатами, фиксация, интеркалирование ДНК. Анализ 50+ параметров невозможен традиционным гейтингом - необходимы вычислительные методы (tSNE, UMAP, FlowSOM). Обслуживание прибора требует навыков работы с масс-спектрометром и газовыми системами. Рекомендуется обучение у производителя и период освоения 2-3 месяца.
Дополнительные материалы
Коды для госзакупок
Возможные коды ОКПД2 для закупки данного оборудования по 44-ФЗ и 223-ФЗ. Выбор кода зависит от назначения и контекста закупки.
Коды КТРУ регулярно обновляются Минфином и зависят от конкретных характеристик закупаемого оборудования (автоматическое/полуавтоматическое, с охлаждением/без и т.д.). Актуальные коды КТРУ доступны только в Единой информационной системе закупок.
Информация о кодах ОКПД2 носит справочный характер. Коды приведены в качестве примера возможных вариантов классификации данного оборудования. Выбор кода, его соответствие нормативно-правовым актам и целесообразность применения определяются заказчиком самостоятельно. ООО «Спин Аналитика» не несёт ответственности за некорректное применение указанных кодов при осуществлении закупочных процедур.